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Resistenzforschung

Phenole als Schutzstoffe der Pflanzen


Nutzung natürlicher Abwehrmechanismen der Pflanzen 

Obwohl im Gartenbau die integrierte Produktion inzwischen weitgehend eingeführt ist, bleibt es noch ein großer Schritt, bis auch pflanzliche Abwehrmechanismen bewußt integriert werden können. In den Verteidigungsstrategien der Pflanzen kommt den phenolischen Inhaltsstoffen eine große Bedeutung zu. 

Phenole können in dreifacher Weise an der Pathogenabwehr beteiligt sein:

1. Als Toxine können sie Pilze oder andere Mikroorga- nismen vergiften und abtöten. 
2. Phenole sind Bestandteile physikalischer Barrieren.

Das Lignin oder Holz ist das bekannteste und wirtschaftlich wichtigste Phenol. Solche physikalische Sperrzonen werden nach Verletzungen der Pflanzenoberfläche mehr oder weniger schnell aufgebaut. Es entstehen verkorkte und verholzte Zellwände. Der Einbau von Phenolen in die Zellulosefibrillen der Zellwand schützt diese vor der Zerstörung durch Mikroorganismen (Pilze, Bakterien).

3. Gerbstoffe sind auf die verschiedenste Weise an der Abwehr von Krankheitserregern beteiligt. Sie können als Toxin wirken oder auch Zellwände imprägnieren, d.h. sie undurchdringlich machen. Darüber hinaus können sie schädliche Stoffe abwehren, die von Pilzen direkt abgegeben werden oder die beim Befall des pflanzlichen Gewebes entstehen. Bei Verletzungen und allgemein bei Streß entstehen aggressive Substanzen, die als "chemische Radikale" bezeichnet werden. Diese verteilen sich im Gewebe relativ schnell und steken gesunde, zunächst völlig unbeteiligte Zellen an. Die Abwehr dieser reaktiven Substanzen erfolgt durch Antioxidantien oder Radikalfänger. Vitamin C und Vitamin E dürften in dieser Hinsicht die bekanntesten Stoffe sein. In der Pflanze kommen noch die Phenole dazu, von denen die Gerbstoffe (Catechine und Proanthocyanidine) besonders wichtig sind. 

Gerbstoffe im Obst - Neue Analysenmethoden aus dem Institut 

Wer schon einmal versucht hat, eine unreife Kakifrucht zu verzehren, der weiß im Prinzip schon, daß Gerbstoffe im Obst eine wichtige Rolle spielen. Das unangenehme, adstringierende Gefühl auf der Mundschleimhaut wird der Obstfreund so rasch nicht vergessen, und zwar mit der Folge, daß er entweder gar keine Kaki mehr ißt oder aber das nächstemal reifere Früchte aussucht, in denen die Gerbstoffe durch die Reifung bereits unwirksam sind. Letztlich auch ein Obstprodukt ist der Rotwein, dessen samtige Eleganz für jeden Kenner mit zum typischen Geschmack eines edlen Gewächses gehört. Hier sind die hauptsächlich in der Traubenschale lokalisierten Gerbstoffe durch die Vergärung auf der Maische mit in den Most gelangt. Wie die Bezeichnung "Gerbstoff" bereits erkennen läßt, wurde und wird diese Stoffgruppe in großem Umfang zur Haltbarmachung tierischer Häute, also zum Gerben von Leder eingesetzt. Dabei macht man sich die Eigenschaft der Gerbstoffe oder Tannine zunutze, Proteine zu binden. Darauf beruht auch der oben erwähnte, zusammenziehende Geschmack unreifer Früchte. Aber nicht nur in den eßbaren Pflanzenteilen finden sich diese Substanzen, auch in den Blättern und in der Rinde vieler Obstarten sind solche Tannine vorhanden. In der Rinde wirken sie zusammen mit der mechanischen Barriere des Korkgewebes als Schutz vor Krankheitserregern. Auch in den Blättern wird die Möglichkeit einer Abwehr pilzlicher und tierischer Schädlinge durch Gerbstoffe diskutiert. Am Beispiel des Apfelschorfs wird diese Frage derzeit am Lehrstuhl intensiv untersucht. Viele Pflanzenhaare, die sogenannten Trichome, enthalten eine konzentrierte Mischung verschiedener Gerbstoffe. Bei Berührung oder Verletzung durch einen Schädling laufen diese Inhaltsstoffe aus und können dann unmittelbar wirksam werden. In ähnlicher Weise könnten die Enzyme von pilzlichen Krankheitserregern durch Kontakt mit den Gerbstoffen inaktiviert werden. 

Wie kann man diese Substanzen im Pflanzengewebe aufspüren?

Um aber die Möglichkeit solcher Wechselwirkungen beurteilen zu können, bedarf es einer zuverlässigen Methode zur Lokalisierung der Tannine auf Zellebene. Elektronenmikroskopische Arbeiten liefern zwar eine hochauflösende Darstellung des Zellinhalts, aber wegen des hohen Aufwands können nur einige wenige Zellen untersucht werden, so daß sich unter Umständen kein repräsentatives Bild ergibt. Außerdem lassen sich anhand des schwarzweißen elektronenoptischen Bildes dunkle Bereiche nicht immer eindeutig als Tannine identifizieren. Hinzu kommt, daß es sich bei den Gerbstoffen um eine sehr heterogene Substanzklasse mit vielfältigen Strukturen handelt, die als gemeinsamen Nenner die Eigenschaft aufweist, Proteine zu fällen. Um mehr Information über die Bedeutung einzelner Substanzen zu bekommen, ist es notwendig, diese separat zu bestimmen. 

Auf die Methode kommt es an!

Mit Hilfe einer ausgeklügelten chemischen Analysenmethode gelingt es, die zahlreichen Einzelkomponenten der Gerbstoffe voneinander zu trennen und mit einem spezifischen Färbereagenz einen sehr exakten Nachweis durchzuführen. Mit der am Institut entwickelten Analysenmethode ist es möglich, einzelne Gerbstoffe separat zu erfassen, ohne den komplexen Pflanzenextrakt aufwendigen Reinigungsschritten unterziehen zu müssen. Da andere Substanzen mit dem speziellen Färbereagenz nicht reagieren, d.h. keine sichtbare Farbe ergeben, bleiben diese Substanzen unsichtbar und stören den Nachweis der Gerbstoffe nicht. Diese Methode hat jedoch immer noch den Nachteil, daß durch die Extraktion nur ein Mittelwert über das extrahierte Gewebe gebildet wird. Einzelne Zellen mit erhöhtem Gerbstoffgehalt, die von entscheidender Bedeutung bei der Abwehr von Schaderregern sein können, werden damit nicht erfaßt. Deshalb wurde parallel zur Analytik auch eine histochemische Methode erarbeitet, um Catechine und die von ihnen abgeleiteten Gerbstoffe selektiv im Gewebe anzufärben. Dabei kommt die bereits erwähnte, äußerst empfindliche Reaktion zwischen Catechinen und einem aromatischen Aldehyd, dem p-Dimethylamino-Zimtaldehyd (DMAZA), zum Einsatz. Die normalerweise unsichtbaren Tannine werden in einen intensiv blau gefärbten Farbkomplex umgewandelt, der lichtmikroskopisch leicht nachgewiesen werden kann. Die Kombination beider Methoden - chemische Analyse und Lokalisierung unter dem Mikroskop - erlaubt nicht nur eine Aussage darüber, welche Gerbstoffstrukturen in einem Pflanzengewebe vorliegen, sondern auch darüber, in welchen Teilen des Gewebes und in welchen Zellen diese Substanzen vorkommen. Denn für eine Interpretation ihrer Wirksamkeit und Bedeutung ist es erforderlich, genau zu wissen, in welchen Zellen diese Gerbstoffe tatsächlich eingelagert werden. Erst dann kann entschieden werden, ob ein solcher Gerbstoff im Pflanzengewebe auch tatsächlich mit dem Krankheitserreger in Berührung kommt. 

Der Einblick in die Pflanzenzelle erfordert zahlreiche Handgriffe im Labor

Bis man das Ergebnis unter dem Mikroskop betrachten kann, sind viele Arbeitsschritte notwendig, da alle Pflanzen aus Zellen aufgebaut sind, deren Durchmesser in der Regel nur die Hälfte eines menschlichen Haares beträgt. Um nun einen Einblick in eine solche Zelle zu bekommen, muß vom Gewebe eine Scheibe abgeschnitten werden, die nicht dicker als eine Zellage sein darf. Andernfalls würden sich die Zellen überschneiden, und es käme kein klares Bild zustande. Dünne Schnitte lassen sich zur Not mit einer ganz frischen Rasierklinge herstellen. Da die Schnittdicke jedoch nicht einheitlich ist, eignen sich solche Präparate nur bedingt für einen Vergleich zwischen verschiedenen Gewebeproben. Außerdem scheiden Frischschnitte für die histochemische Untersuchung des Zellinhaltes wegen der unvermeidbaren Verschleppung von Inhaltsstoffen während des Schneidens ohnehin aus. Es ergibt sich also die Notwendigkeit einer möglichst schonenden Abtötung des Gewebes unter gleichzeitiger Erhaltung der Zellstruktur. Dieser Vorgang wird als Fixierung bezeichnet. Es sind verschiedene Fixierungsgemische im Gebrauch, die alle ihre Vor- und Nachteile haben. Eine Fixierung mit Aldehyden liefert im allgemeinen die besten Ergebnisse. Dazu werden möglichst kleine Stückchen des zu untersuchenden Gewebes für mehrere Stunden in die Fixierlösung gelegt. Der nächste Schritt besteht in einer stufenweisen Entwässerung des Gewebes, meist mit Ethanol steigender Konzentration. Daran anschließend wird das Gewebestückchen in ein Medium eingebettet, das der Stabilisierung des Objekts während des Schneidens dient. In der herkömmlichen Histologie wird als Einbettungsmedium ein spezielles, gereinigtes Paraffinwachs verwendet, welches im flüssigen Zustand langsam in die fixierten Zellen eindringt und nach dem Erkalten leicht geschnitten werden kann. Die Methode ist aber ziemlich umständlich, Artefaktbildungen sind leicht möglich. Deshalb wird am Obstbauinstitut mit einem wassermischbaren Flüssigkunststoff gearbeitet, der in das Objekt eindringt und anschließend durch Zugabe eines Katalysators aushärtet. Diese Technik hat sich sehr gut bewährt und erlaubt im Vergleich zu Paraffineinbettung die Anfertigung wesentlich dünnerer Schnitte. So kann eine Zelle im Durchschnitt in 20 bis 30 einzelne Scheiben geschnitten werden. Die Herstellung von solch unvorstellbar dünnen Schnitten erfordert einen speziellen Apparat, das sogenannte Mikrotom. Es handelt sich dabei im wesentlichen um einen äußerst präzisen Hobel, der mit einem diamantgeschliffenen Hartmetallmesser bestückt ist. Die damit angefertigten Schnitte läßt man zunächst in ein Wasserbad fallen, wo sie durch die Oberflächenspannung des Wassers gestreckt werden. Anschließend werden die Schnitte auf einen Objektträger aus Glas aufgezogen und bei leicht erhöhter Temperatur angetrocknet. Im Prinzip könnte man die Schnitte bereits jetzt unter dem Mikroskop betrachten. Nur lassen sich kaum Einzelheiten des Gewebes erkennen, da das ungefärbte Präparat einen zu geringen Eigenkontrast aufweist. Deshalb schließt sich noch eine Färbung an, die entweder das ganze Gewebe mehr oder weniger stark kontrastiert, oder die in der Lage ist, selektiv bestimmte Zellbestandteile zu färben. Wir waren von der Lokalisierung der Gerbstoffe ausgegangen und haben bereits eine solche Selektivfärbung auf Catechingerbstoffe kennengelernt. Diese Färbung ist zwar sehr empfindlich, ihre Intensität kann aber durch eine Fixierung des Gewebes mit den oben erwähnten Aldehyden stark reduziert werden. Will man nicht auf die vorteilhaften Fixiereigenschaften der Aldehyde verzichten, so muß diese Hemmung irgendwie überwunden werden. Eine einfache, aber wirkungsvolle Möglichkeit dies zu erreichen, besteht nun darin, die Färbelösung während des Färbevorgangs zu erhitzen. Je intensiver dies geschieht, desto kräftiger wird die blaue Farbe. Um die Färbelösung für wenige Sekunden zum Kochen zu bringen wurde ein handelsübliches Mikrowellengerät verwendet. Obwohl sich Schwefelsäure im Reagens befindet, werden die Schnitte dank der Kunststoffeinbettung durch diese doch recht unsanfte Behandlung nicht zerstört. Im Anschluß an den Färbeprozeß wird das überschüssige Reagens ausgewaschen. Die gefärbten Schnitte werden mit etwas Kanadabalsam, das ist ein spezielles Harz mit einem ähnlichen Brechungsindex wie Glas, eingeschlossen und mit einem dünnen Glasplättchen abgedeckt. Die so hergestellten Präparate sind praktisch unbegrenzt haltbar und können jederzeit unter dem Mikroskop ausgewertet werden. Zellen mit Catechingerbstoffen erscheinen blau gefärbt, solche ohne Tannine sind nur schwach kontrastiert. 

Lokalisierung der Gerbstoffe in spezialisierten Zellen

Die Gerbstoffe kommen häufig nur in spezialisierten Zellen, dort aber in sehr großen Mengen vor. Meist erscheinen sie in der Vakuole als große Tropfen, bisweilen auch als schmales Band entlang der Innenseite der Vakuolenmembran. Häufig treten auch sehr feine Kügelchen in der Vakuole auf, die dann offenbar zu größeren Gebilden zusammenfließen. Die Zellen im Abschlußgewebe der Rinde sind meist ganz mit Gerbstoffen ausgefüllt und erscheinen unter dem Mikroskop dunkelblau. Gerbstoffe können schädliche UV-Strahlen abfangen. So erscheint es nicht verwunderlich, daß in Tannennadeln von Bäumen, die unter extremen Umweltbedingungen aufwachsen, gerade diese Substanzen in sehr hoher Konzentration vorliegen. Tannenbäume, die im Schwarzwald in 850 m über Meereshöhe wachsen, sind viel stärkerer UV-Einstrahlung ausgesetzt als solche in Orléans (100 m) oder in Stuttgart (300 m). Analysiert man die Catechine solcher Tannennadeln, so läßt sich feststellen, daß Bäume in extremeren Lagen ihr Gewebe durch einen höheren Gehalt an Gerbstoffen schützen. Bei Sorbus-Arten sind die Gerbstoffe in speziellen Rindenzellen eingelagert. Die Pflanze leistet sich also nicht den Luxus, alle Zellen mit den unter erheblichem Energieaufwand zu synthetisierenden Gerbstoffen anzufüllen. Lediglich zwei Zellreihen haben offensichtlich die Aufgabe, durch eine spezielle Anreicherung von Gerbstoffen das darunterliegende Gewebe vor Eindringlingen von Außen zu schützen. Diese Zellen sind darauf spezialisiert, Phenole zu bilden. Auch in vielen anderen Pflanzen findet man Gewebe, denen eine gewisse Schutzfunktion zuzuschreiben ist. Beispiele hierfür sind insbesondere die Phellodermschichten der Rinde sowie Blatthaare. Im Zusammenhang mit einem allgemeinen Schutzmechanismus ist natürlich auch zu erwarten, daß verletzte Pflanzengewebe, die plötzlich völlig veränderten Bedingungen ausgesetzt sind, ihre eigentlichen Funktionen umstellen und Substanzen produzieren, die die fehlende Rinde ersetzen können. Es verwundert deshalb nicht, daß verwundete Pflanzenteile plötzlich in verstärktem Maße Phenole bilden. Wir waren vom unangenehmen Geschmack der gerbstoffreichen Kakifrucht ausgegangen und haben einen weiten Bogen geschlagen über die Bedeutung dieser Substanzen als chemisches Schutzschild der Pflanze bis hin zur zur selektiven Lokalisierung von Catechingerbstoffen unter dem Mikroskop. Die vorgestellte Methode sollte es ermöglichen, in Zukunft wichtige Fragen nach dem Zusammenhang zwischen Gerbstoffanreicherung und Krankheitsresistenz noch gezielter zu bearbeiten. Besonders im Zusammenspiel mit den bereits erwähnten Möglichkeiten der chemischen Analytik können neue Erkenntnisse über dieses noch weitgehend unerforschte Gebiet gewonnen werden. 

Gerbstoffgehalt in verschiedenen Pflanzengeweben

Art

Blatthaare

Narbe

Griffel

Phelloderm

Acer platanoides L.

+++

+

++

+++

Actinidia argute (Sieb. et Zucc)

0

+++

+++

++

Aesculus hippocastanum L.

+

0

0

+++

Juglans regia L.

0

+

+

++

Prunus cerasus L.

0

+

+++

+++

Prunus sargentii Rehd.

++

0

+

++

Prunus subhirtella Mig.

+++

0

+

++

Sorbus aucuparia L.

0

0

+

+

Tilia grandifolia Ehrl.

+

+++

+++

++


Unterschiedliche Verteidigungsstrategien

Pflanzliche Abwehrstoffe können entweder schon vor eine Infektion vorliegen (präformierte Substanzen), um ein Eindringen von Erregern zu verhindern, oder sie werden erst nach erfolgter Infektion gebildet, um den Schaden zu begrenzen (postinfektionelle Substanzen). Eine wichtige Gruppe der postinfektionellen Abwehrstoffe nennt man Phytoalexine. Diese werden 6 bis 10 Stunden nach einer Infektion neu gebildet. Außer bei Infektionen kann eine Neusynthese der Abwehrstoffe auch schon durch Streß oder Verwundung ausgelöst werden. Phenole schützen nicht nur gegen Insekten und Mikroorganismen sondern dienen außerdem als eine Art Filter gegen ultraviolette Strahlung. Präformierte Schutzstoffe sind deshalb sinnvollerweise in den äußeren Gewebeschichten vertreten. Am Obstbauinstitut wurden in Haaren (Trichomen) auf Früchten (Stachelbeere), Blättern (Kirsche, Wallnuß, Ahorn, Linde) und sogar in Knospen (Kastanie) Phenoleinlagerungen nachgewiesen. Solche Phenol-Anreicherungen wurden auch in Spitzen der Blattzähnung (Kirschen), in grünen Fruchtschalen (Walnuß, Apfel), in äußeren Rindengeweben (Walnuß, Linde, Robinie) und in Griffeln (Kirsche, Linde) gefunden. Postinfektionelle Anreicherung von Phenolen sind ebenfalls in unterschiedlichen Systemen untersucht worden. In Blättern, die durch Minierfraß geschädigt wurden, nach Hagel (Apfel) oder nach Pilzinfektionen (Stachelbeermehltau, Schrotschuß an Kirsche, Birnengitterrost, Birnen- und Apfelschorf, Weißfleken- und Rotfleckenkrankheit bei Erdbeeren) wird die Phenol-Synthese aktiviert. Mit den heutigen Nachweismethoden wurden in solchen Fällen Anstiege um das 3 bis 10-fache beobachtet. Es fällt immer wieder auf, daß die Phenolzone nur eng um die Wunden herum begrenzt ist. Die bisher nur selten beschriebene Beobachtung einer Phenolanreicherung in der Nähe von Infektionen oder Verwundungen begründet sich zum Teil mit den unzureichenden methodischen Möglichkeiten. Neuere Erkenntnisse weisen darauf hin, daß sich Phenole nur in sehr wenigen Zellen in der unmittelbaren Umgebung der Infektionsstelle anreichern. Dieser Nachweis gelingt nur mit sehr exakten und spezifischen Methoden. Der sehr abrupte Übergang von einer Abgrenzungszone zum gesunden Gewebe ist bemerkenswert. Bei der Probenahme für biochemische Analysen ist deshalb größte Vorsicht geboten, damit die Ergebnisse auch korrekt interpretiert werden können.