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Gewebekultur und Mikrovermehrung im Reagenzglas

Physiologische Vorgänge und Probleme der Gewebekultur 


Die Etablierung des Meristems

Der auf Meristemgröße reduzierte Vegetationskegel verfügt an seiner basalen Schnittstelle über ein Wundgewebe, das etwa ein Viertel der gesamten Oberfläche einnimmt. Eine Wunde von dieser Größe beeinflußt den Stoffwechsel des gesamten Meristems in sehr starkem Maße. Es kann über die sogenannte Etablierungsrate (Überlebensrate der Meristeme im Glas) entscheiden. 

Die Phase der Zellteilung und Differenzierung

Wenn die winzige Sproßspitze den ersten Schock überwunden hat, kann die weitere Entwicklung ihren Lauf nehmen. Die Pflanzenentwicklung setzt Zellteilung voraus. Teilungsrate und -dauer sind jedoch hormonell gesteuert. Dies gilt ebenfalls für die Teilungsebene, wenn aus einer Zelle zwei werden. So kann durch Steuerung der Zellteilungsebene aus dem zunächst scheinbar ungeordneten Zellhaufen (Kallus) ein koordiniertes Gewebe oder sogar ein Organ werden. Dieser grundsätzliche Aspekt kommt bei der Gewebekultur voll zur Wirkung. Man kann die Entwicklung so beeinflussen, daß aus der Zellteilung eine Wurzel, ein Blatt oder eine Achselknospe wird. Bei stets gleicher tangentialer Teilungsebene der Zellen unterhalb des Spitzenmeristems ergibt sich die sehr wichtige Achsenstreckung. Die aus der Teilung entstehenden Zellwände sind ziemlich fest miteinander verbunden und verleihen dem jungen Sproß eine deutliche Festigkeit. Nach der Streckungsphase kommt es zur stärkeren Differenzierung der Einzelzellen der Sproßachse in Xylem, Kambium, Phloem und Rinde. Der höhere Differenzierungsgrad ist an einen Verlust der einheitlichen Teilungsebene gekoppelt, dem auf jeden Fall eine hormonelle Umstimmung vorausgeht. Die Teilungsebene ist nicht mehr an eine bestimmte Richtung gebunden, was vor allem im Phloem (ausgenommen die Strahlen) sichtbar wird. Die entscheidende Phase der Meristemkultur ist die Blattentwicklung. Sie beginnt im sogenannten Flankenmeristem, das durch intensivere Zellteilung eine Ausstülpung an der Sproßspitze hervorruft. Die Anordnung der Blätter rings um die Sproßachse ist präzise gesteuert und auch in der Gewebekultur ziemlich stabil. Problematisch ist dagegen die Blattgröße und die Streckung des zugehörigen Internodiums. Häufig tritt eine Stockung der Entwicklung auf, so daß keine funktionsfähige Pflanze entstehen kann. Diese Stockung wird häufig durch fehlende Gefäßverbindung zwischen Hauptachse und Laubblatt oder Wurzel verursacht. Auxinmangel wird dafür verantwortlich gemacht. Die spätere Verdickung und Holzbildung ist ebenfalls vom Auxin, aber auch vom Gibberellin abhängig. Man geht davon aus, daß Gibberellin eher die Kambialzellen zur Teilung veranlaßt, die nachfolgende Differenzierung derselben wird jedoch stark vom Auxin gesteuert. Dies dürfte vor allem für das hoch differenzierte Phloem (Siebzellen) von Bedeutung sein. In Abhängigkeit von der Bauart kann Gibberellin sehr stark den Holzkörper der Sproßachse verdicken. Über eine kräftige Sproßachse kann die Vermehrungsrate erhöht werden, da sich an ihr kräftige Seitenknospen entwickeln. Diese werden bekanntlich abgetrennt und weiter vervielfältigt. Die etablierten Sproßachsen, ob in der Vermehrungsphase oder in der Bewurzelungsphase, sind somit ein gemischtes System aus meristematischen und ausgereiften Zellen. Letztere sind in der Regel großlumiger und stärker in Organellen und Kompartimente differenziert. Dadurch wird die Syntheseleistung erhöht. Größere Zellen haben in der Regel einen aktiven Pentose-Phosphat-Zyklus, im Vergleich zur Glykolyse. Phenolsynthese kann eine Konsequenz davon sein. Große Bündelscheidenzellen um die Gefäßbündel in Blättern weisen erhebliche Mengen an Phenolen auf. Ausreifende Zellen verstärken auch die Wanddicke. Das Material hierzu muß in der Zelle produziert und durch das Plasmalemma transportiert werden. Dies trägt zur Versteifung des ganzen Gewebes bei. 

Steuerung der Organogenese durch Kompetenz der Zellen

Der einfachen Pflanzenzelle stehen verschiedene Möglichkeiten der Weiterentwicklung (Differenzierung) offen. Die "Kompetenz" einer Zelle, das heißt ihre Fähigkeit, auf gewisse Einflußfaktoren (induktive Faktoren, wie z. B. Hormone) antworten zu können, entscheidet über das weitere Schicksal. Die Zeitphase, eine bestimmte Kompetenz zu erreichen, kann verschieden lang sein. Über eine Vorbehandlung oder direkte Behandlung mit Hormonen wird, wenn überhaupt, die Kompetenz zur Differenzierung erreicht. Auch andere Substanzen können dafür verantwortlich sein. Die Kompetenz ist an Entwicklungsphasen der Pflanzen/Gehölze und an die Position eines Gewebes innerhalb des Baumes gebunden. Deshalb kann die Organogenese in der invitro-Kultur nicht generell erzwungen werden. Die Kompetenz ist eben zeitlich wie örtlich beschränkt. Sie kann auch insoweit eingeschränkt sein, als bestimmte Gewebe nur eine einzige Differenzierungsrichtung, z.B. Wurzeln, einschlagen können. Die Realisierung der Kompetenz (Organbildung) hängt stark von der Kommunikation zwischen den einzelnen Zellen ab. Die Diffusion der organ-induktiven Substanzen von einer Zelle zur anderen ist nicht selbstverständlich. Die Zelldurchgänge (Plasmodesmen) ändern schnell die Struktur und damit die Passierbarkeit. Kleinere Moleküle, zu denen die Hormone gehören, können leichter passieren. Eine mehr oder weniger starke Blockade kann durch Calcium erfolgen, wobei schon eine geringe Anhebung des Calciums genügt. 

Das Geheimnis liegt im Nährmedium 

Gegenüber der Kultur im Freiland bietet die Pflanzenanzucht im Reagenzglas einige Vorteile. Die physikalischen Umweltfaktoren (Licht, Temperatur) sind exakt einzustellen. Der alles entscheidende Faktor ist jedoch die Zusammensetzung des Nährmediums. Dieser Cocktail (sämtliche Chemikalien und Nährstoffe) kann exakt mit der Analysenwaage zubereitet werden. Im engen Reagenzglas ist die Sicherheit gegeben, daß alle Faktoren am gewünschten Pflanzenteil tatsächlich zur Wirkung kommen. Nährstoffe, Vitamine und Hormone können beliebig in ihren Konzentrationen verändert werden. Leider sind die Variationsmöglichkeiten größer als beim Lotto, so daß die Einkreisung eines Problems auch bei übermenschlicher Anstrengung oft sehr schwierig ist. Nur ein ausgezeichnetes theoretisches Wissen hilft dem Experimentator, die Versuchsbreite auf heiße Spuren zu reduzieren und damit die Erfolgschance zu erhöhen. Das Studium der Kallusbildung in Laborversuchen ermöglicht eine schnelle Erfassung derjenigen Hormonkonzentrationen, die notwendig sind, um das Kambium zum Kalluswachstum zu aktivieren. Hieraus lassen sich zugleich Rückschlüsse auf die Verhältnisse in der Natur selbst ziehen. Auch was die Wurzeldifferenzierung betrifft, läßt sich in der Gewebekultur sehr viel besser als im Freiland mit allen möglichen Faktoren spielen, um die internen Prozesse zu erfassen. Auch die Phase der Wurzeldifferenzierung ist strikt von der Wurzelstreckung zu trennen. Denn beide Prozesse bedürfen eines völlig unterschiedlichen Hormonniveaus. Es kommt vor - besonders bei schwierig zu bewurzelnden Obstarten -, daß zwar im Kambiumbereich viele Wurzelanlagen gebildet werden, diese sich jedoch nicht strecken und so praktisch keine Wurzeln äußerlich an der Sproßbasis erscheinen. Die Streckung der Wurzelspitzen wird unter Umständen dadurch verhindert, daß das Konzentrationsniveau des Auxins (z.B. der Indolbuttersäure im Nährmedium) oder der endogene (d.h. pflanzeneigene) Hormonlevel zu hoch sind. Somit ist in der Pflanze eine enzymatisch gesteuerte Dynamik der Indole notwendig, daß entweder Wurzeln und oder nur Wucherzellen (Kallus) erscheinen. Ein relativ hohes Auxinniveau, notwendig bei der Wurzelanlage, muß im Verlaufe von zwei Wochen stark absinken, wodurch dann die Streckung ausgelöst wird. 

Die Subkulturen - oder: Was lange währt... 

Die Induktion der Organogenese ist beispielsweise bei einigen Johannisbeersorten äußerst problematisch. Nach der Entnahme eines Meristems hängt das Überleben der schweren Operation von der optimalen Kondition des Ausgangsgewebes und von möglichst geringen Schadwirkungen des neuen Nährmediums ab. Auch wenn das eingesetzte Gewebe überlebt, heißt es noch nicht, daß es sich sofort zu einer Pflanze weiterentwickelt. Es kann zunächst "sitzen" bleiben. Auch während dieser Zeit werden die Bestandteile des Nährmediums aufgezehrt und das Explantat muß auf ein "frisches" Medium umgesetzt werden. Man spricht dann von einer "Subkultur". In solchen Subkulturen kann es zu sogenannten "epigenetischen" und damit auch physiologischen Veränderungen kommen. Als extremes Beispiel sei die Sorte 'Rondom' genannt. Ein etabliertes Meristem blieb 4 Jahre lang bei insgesamt mehr als 37 Subkulturen auf derselben Entwicklungsstufe sitzen. In den folgenden Subkulturen sind kontinuierlich jeweils ca. 10 Seitensprosse entstanden. Diese konnten auch bewurzelt werden, zeigten dann allerdings unterschiedliche morphologische Entwicklungen. 

Äußere Veränderungen ohne Wandel des Erbguts

(epigenetische Veränderung) 

Der Terminus epigenetisch wurde für solche Phänomene eingeführt, die sich zwar äußerlich sichtbar ausdrücken und sich auch nach der Verklonung noch zeigen, jedoch keine permanente Veränderung des Genotypes, also des Erbgutes, darstellen. Dieser Typus der Variation macht bei der vegetativen Vermehrung allgemein Schwierigkeiten. Bekannt geworden ist der Einfluß der Jugend und Altersform auf den Habitus der verklonten Explantate bei Baumgehölzen. Bei sehr jungen Pflanzen sind solche Veränderungen häufig extrem schwer festzustellen. Mit Hilfe chemischer Analysen hat man jedoch die Möglichkeit, einen genauen Einblick in den Stoffwechsel zu bekommen. Anhand von Enzymen wurde bei Prunus cerasus geprüft, ob Veränderungen vorlagen, ob sich Pflanzen die über Grünstecklinge herangezogen wurden, von solchen aus in vitro-Kulturen unterschieden. Die Überprüfung der Enzyme brachte ein sehr hohes Maß an Übereinstimmung in der Anzahl und Position der einzelnen Banden. Demnach lagen geringe Stoffwechseldifferenzen vor. Die befürchteten Modifikationen des Stoffwechsels waren bei P. cerasus jedenfalls auszuschließen. Die in vitro Methode hat den Stoffwechsel, soweit diese Experimente eine Beurteilung zulassen, nicht verändert.